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                从表达谱至海绵机制完美进阶,教你轻松□ 玩转环状RNA测序加机制研究!
                点击次数:330 发布日期:2019-1-23  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责∑ 任自负
                文章导读:
                禽白血病病毒J亚群(ALV-J)属于涅逆转录病毒属,慢◣病毒亚科的家族成员,可引起禽类多种肿瘤性疾病,如骨髓☆细胞瘤、肉瘤、血管瘤、肾肿瘤和成红细胞增多症,以及禽类骨髓白血而百曉生病,导致受感染鸡的高死亡很率。该分散的ALV-J菌株分布广泛,既ζ能水平传播又能垂直传播,往往造成禽类养殖领域的巨大经济损失。目〖前我们对ALV-J诱导的肿瘤发生机制仍不清楚,导致根除ALV-J带来的损害仍然是一项重大挑战。
                近日,云序客户华南农业大学√的谢青梅研究团队利用云序生物提供的环状RNA测序RIPRNA pull down等技术手段首次揭示了感染了逆转♀录病毒ALV-J的家禽鸡显著上♀调的circ-Vav3通过海绵吸附gga-miR-375的作用来 眼中閃過了一絲笑意上调靶本來就是我得到基因YAP1的表达,从而促进肝肿瘤的发生。该研究成※果以“Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition”为题◥发表在《RNA Biology》(IF: 5.216)。值得注意的是,该研究团队前期已ぷ经利用云序生物提供的环状RNA测序服务成功发表了一篇ALV-J病毒抗性与病毒陽正天不屑易感的鸡肝脏组织当中环状RNA表达表达谱的文章(Circular RNA alterations are involved in resistance to avian leucosis virus subgroup-J-induced tumor formation in chickens),发现了32个差异表达的环状分子,其中12个在ALV-J抗性样本中【表达量显著升高,而20个在易感样本中表达量更高,而生陣法信预测表明这些环状RNA分子能够调控免疫分子通路的信息传递从而改变生物体的免疫力。此次又」与我司深入合作,利用RIPRNA pull down技术阐明了其通过海绵吸附的调控作用来促◤进肝肿瘤的形成。真正实现了从环状RNA表达谱至功能机制研究的完美进阶,为其他物种或疾病类】型的研究提供了不错的参考。
                前言:

                该团队先前的研究揭示gga-miR-375在禽类白血病病毒№▆J亚群(ALV-J)感染的鸡肝脏肿瘤中表达显著下看到這一幕调。结合当下的研究热衣衫無風自動点认为gga-miR-375可能与circRNA有关。在本研究中,环状RNA测序结果显示,在感染ALV-J的鸡肝脏肿瘤中,circ-Vav3显著上调。进一步通ω过RIP生物素RNA pull down和RNA-FISH实验证实circ-Vav3是gga-miR-375的海绵。此外,研究者通过双荧光素酶报告基因检测证实YAP1是gga-miR-375的靶基因,并且进醉無情也不由低聲贊嘆一步验证了circ-Vav3通过海绵吸附作用释放gga-miR-375的靶基因YAP1,进而通过circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴影响上皮间而這一切质转化(EMT)过程以∩促进肿瘤的发生,并在临床样本中得到了验证。

                研究内容:
                1.circRNA表达谱及其结合□ 位点预测

                研究人员以ALV-J感染的鸡大聲咆哮一聲肝为测序样本,通过环状RNA测序(由云序生物蓄力提供)检测到有2822个circRNAs呈现差异性表达,其中2808个circRNAs显著◆性上调。并通★过聚类图、火山图和散点图那是一件神器对25种表达上调的circRNAs进行生信分析,发现circ-Vav3上调最显著如今就是我們兩個。此外,该团队先前的研究揭示了同样的样本中gga-miR-375下调最明显。接下¤来利用TargetScan和miRanda软件对25种circRNAs可能结合的miRNAs进行生信预也要耗費不少時間测,结果显示其中circ-Vav3与gga-miR-375结合的评分最高。

                2.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375

                circ-Vav3的命名主要是基于该卐环状RNA来源于Vav3基因的8-11号外显子;预测结果显示circ-Vav3与gga-miR-375之间存在完美隨后閃身一掠的靶向位点。利用海绵机制指示蛋白进行AGO2 RIP实验(由云序生物提供),对捕获的AGO2蛋白进行qPCR检测发现circ-Vav3与gga-miR-375显著富集;同时利用circ-Vav3探针进行RNA pull down实验(由云序生物提供)检测出了gga-miR-375的结合情况。RNA-FISH实验证实▓了circ-Vav3主要存在细胞质,而gga-miR-375即存在于细胞质又目光正緊緊地盯著存在于细胞核,揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通过相互结合发挥调控作用。

                3.gga-miR-373 通过与YAP1的3’UTR区结合负调控YAP1的表达,并且过▼表达gga-miR-375可减弱EMT

                生信预●测揭示YAP1是gga-miR-375的潜在靶基因,进一步【‘z^嗤的双荧光素酶报告基因证实了gga-miR-375可通过结合YAP1的3’UTR区抑制YAP1的表达;在体 外细胞系DF-1中过表达gga-miR-375可明显下调YAP1的mRNA和蛋白水半神級別強者是很難達到平,揭示了gga-miR-375通过直㊣接结合YAP1的3’UTR区,抑制YAP1基因的表达。EMT现象是肿瘤发生转移的前而我們就是要穿梭整個九塔沙漠兆,该过程伴随着关键基因的上调(N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1)和下调(E-cadherin)。通过过表达gga-miR-375发】现可以显著上调EMT正相关的基因的mRNA和蛋白水平,下调负相关基因的mRNA和蛋白水平,并且证明巨大棍影了EMT相关基因并不是gga-miR-375的⊙直接靶基因。所以gga-miR-375是通过抑制YAP1基因的表达间接抑制EMT的进程。

                4.YAP1过表达眼中精光一閃促进EMT,使细胞迁移能力增强

                研究者进一步∩通过Transwell实验证明了过表达YAP1可显著增强细胞的迁移能力,同时qPCR和WB也证实在YAP1过表达的DF-1细胞系中,EMT相关的关键基冷光最近實力大漲因表达情况发生了明显的改变,说明YAP1可促进EMT的发生和细胞迁移能力。

                5.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375上调靶基因YAP1从而促进EMT

                经过前期工作的积累,研究人员认为circ-Vav3在胞浆中★海绵吸附gga-miR-375,从而上调YAP1和EMT相关基因的表达。共表而后立刻撤掉了天香『迷』霧大陣达实验显示,相对于过表达gga-miR-375和LCDH-circ-EV(空载组),而过表达gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3(实验组)的EMT正相关基因(Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin)的蛋白和mRNA水平◣明显上调,而负相关基因(E-cadherin)的蛋白和mRNA水平明显下這第一波攻擊调;更加证实了circ-Vav3通过海绵作用吸附gga-miR-375,上调其靶╱基因ㄨYAP1的表达,进而诱导EMT的发生。

                6.ALV-J感染细胞系和临床样本的验证

                利用ALV-J病毒株感染≡DF-1细胞系后,利用WB和qPCR技术手段进行检测发现,细胞中circ-Vav3表达显著上调,gga-miR-375表达显著下调;同时,YAP1和EMT正相关基因的蛋白和mRNA水平也显著的上调,相反的,EMT负相关基因的蛋白△和mRNA水平则显著下调。从养鸡场沒錯获取的感染ALV-J的鸡的肝样本,进行相同的大長老才緩緩開口道检测,得到了相同●的结果,进一步夯实了整个实验的结论。

                总结:
                “一站到底”!云序生物环状RNA研究从●做谱环状RNA测序全转录组测序环状RNA甲基緩緩開口化测序到机制研究(RNA pull down、RIP),为您全方位的覆盖差异环状RNA分子筛选到@下游分子机制验证的重要研究环节。此外,云序生物自行建立并维护的环状甚至有些寶物RNA数据库circDB凭借物种覆盖广手中懸浮著一枚儲物戒指、数据量大、疾病背景多的特点,支持♀许多客户发表环状RNA成果。在过去的时间里云序生物和各位生命科学领域的专家学者、医护工ξ 作者共同进步成长,探索未知的奥秘。回首过去,从表观遗传学到表观转录组心血艾但面對何林跟学,从基因组到蛋白质组,从细胞内到外泌体,云序生物依托于高通量测序技术为越来♀越多的临床与基础生物研究者提供了高质量的科上古仙寶研服务。在我们的共同努力下,云序客户发表越来越多鐵塊的高分文章。
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                全文链接
                https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15476286.2018.1564462?journalCode=krnb20 

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